Показавшие «цинковый палец» СПИДу

В издательстве Альпина нон-фикшн вышел перевод книги Кевина Дейвиса «Редактируя человечество: Революция CRISPR и новая эра изменения генома». IQ.HSE публикует из неё фрагмент, посвящённый тому, как учёные начали редактировать гены, связанные с устойчивостью к ВИЧ-инфекции, благодаря чему смогли вылечить более ста пациентов.

С 1997 года штаб-квартира компании Sangamo располагалась на территории Пойнт-Ричмонда в здании, которое использовалось совместно с Pixar, анимационной студией, создавшей «Историю игрушек» и «Приключения Флика», а позже приобретенной Disney. Когда Pixar переехала в другую, более крупную штаб-квартиру в Эмервилле, Sangamo расширила свои площади. В течение трёх лет генетики Урнов и Холмс делили офис, который раньше у Pixar был кинозалом. 

Урнов рассказывает, что их сотрудничество было сродни партнерству Леннона и Маккартни. Правда, позже он признает, что это некоторое преувеличение. Команде Sangamo помогал Мэттью Портеус, учёный-врач из Стэнфорда, который когда-то учился вместе с Дэвидом Балтимором. Он был также вдохновлен статьями Кэрролла о нуклеазах типа «цинковых пальцев» (ZNFs) и хотел заставить их работать в клетках человека. Портеус создал метод анализа с использованием зелёного флуоресцентного белка, который мог сообщать об успешном воздействии на ген при помощи ZNFs.

Молодые таланты Sangamo выполняли задание, они не имели права на ошибку. «Ничто не вызывает такого чувства срочности, как присутствие на бирже NASDAQ», — говорит Урнов. В течение следующих нескольких лет в Sangamo смогли придумать, как сделать из ZFNs эффективные редакторы генов. В качестве мишеней выступало множество болезней: серповидноклеточная анемия, гемофилия и тяжелый комбинированный иммунодефицит (ТКИД). (Урнов и Холмс даже пробовали внести изменения в ген CCR5.) Поскольку все ещё помнили неудачу, случившуюся с французской генной терапией, Sangamo начала искать способы исправить генетический сбой у пациентов с ТКИД — мутацию в гене гамма-рецептора интерлейкина-2 (IL2Rζ).

Однажды Урнов смотрел на результаты, выдаваемые лабораторным прибором под названием «флуоресцентный сканер». «Похоже, мы достигли успешности редактирования генов один к пяти, — Урнов поделилcя результатами с Холмсом. — Если это правда, значит, мы только что вступили в новую эру!». Холмс согласился, уже планируя следующие эксперименты, проверить полученные данные, в то время как Урнов в возбуждении расхаживал по комнате. 

«Экстраординарные заявления требуют экстраординарных доказательств. Мы оба знали, что так просто нам никто не поверит!» — вспоминает Урнов. Они никому не рассказали о своих результатах, но в то же время тайно проводили все контрольные эксперименты, какие только могли придумать. Задел, которым обладала Sangamo, начал приносить плоды. «Мы наконец-то собрали мощный мотор для машины с превосходными шинами и супераэродинамичным корпусом, а также построили суперплоскую гоночную трассу».

Урнов и Холмс наблюдали коррекцию генов — нуклеаза, обладающая «цинковыми пальцами» (ZNFs), создавала разрыв в ДНК, заменённый фрагментом генетической информации. Они включили в группу Грегори, Ребара и Миллера и придумали эксперимент, чтобы окончательно исключить возможность появления артефакта, вызванного загрязнением образца. 

Урнов выбрал клетку, гомозиготную по редактируемому гену. Если бы произошло заражение, то они бы всегда наблюдали две различные копии гена. Но если бы обнаруживалась только вводимая последовательность ДНК, это бы означало, что исходный ген был заменен — отредактирован — внешней последовательностью. 

На протяжении субботы и воскресенья Урнов анализировал группу отредактированных клеток. Несколько первых были нормальными, неизменёнными, а значит, неинтересными. Следующей была гетерозигота — один нормальный аллель, другой изменённый. Это происходило до тех пор, пока — о, счастье! — он не нашёл клетку, в которой обе копии гена были изменены. Урнов быстро сбросил электронное письмо Холмсу: «ГОМОЗИГОТА!!! За которой вскоре последовала ЕЩЁ ОДНА гомозигота!!!»

Русская пословица гласит: «Взялся за гуж — не говори, что не дюж». Пришло время приоткрыть занавес и закончить важнейшее научное исследование. В качестве последнего доказательства Урнов провел самый важный эксперимент в своей жизни — Саузерн-блот, весьма трудоёмкий метод, разработанный Эдом Саузерном в 1970-х годах, в котором фрагменты ДНК замысловатым образом высасываются из геля и переносятся на нейлоновую мембрану с помощью абсорбента в виде десятисантиметровой стопки бумажных полотенец. А Холмс показал, что они могут устранить внесённое изменение, и провел эксперименты не только на опухолевых лабораторных культурах, но и с лейкоцитами конкретных пациентов.

Перед отправкой статьи в журнал Nature один из главных консультантов Sangamo, сэр Аарон Клуг, предложил Урнову с коллегами использовать термин «высокоэффективная генная коррекция», а не «модификация». (Копия рукописи, содержащая комментарии Клуга, написанные им от руки, остаётся одной из самых ценных вещей Урнова.) После двух этапов рецензирования в апреле 2005 года журнал Nature опубликовал статью, в которой были переписаны правила генной терапии. 

Компания Sangamo продемонстрировала возможность исправления генетических мутаций у человека. Более того, этот метод позволял избежать проблем инсерционного мутагенеза, который омрачил испытания генной терапии во Франции. «Принцип работы ZFNs — бей и беги — делает терапевтически полезные изменения, внесённые в геном, не зависящими от необходимости интеграции экзогенной ДНК, в то же время клетка навсегда остается модифицированной», — писал Урнов.

Когда редакторы Nature попросили предложить идеи для заголовка на обложке, Урнов выдвинул вариант: «Редактирование генома». (В тот момент его отец только что стал главным редактором российского литературного журнала.) Через пять лет после создания первого наброска генома человека учёные показали, что изменить язык жизни возможно, если необходимо устранить генетическое заболевание.

Сэм Джаффе из журнала Wired сообщил о знаменательной технологии «нанохирургии» с заголовком, который, я надеюсь, обеспечил редактора премией: «Показывая палец генетическому заболеванию». Джаффе процитировал Дэвида Балтимора: «Это не просто позволяет доставить чужеродный ген в клетку. Это делает возможным фактически удалить неправильно закодированный фрагмент и решить проблему». Воздействовать на любой ген в геноме стало очевидной реальностью. Рецензия Чандры на статью в Nature Biotechnology была озаглавлена: «Волшебные ножницы для геномной хирургии».

Следующим шагом был переход к лечению пациентов с ТКИД, что требовало провести редактирование гена в стволовых клетках. Но, к отчаянию команды, все, что они смогли сделать, — это небольшие вставки и делеции последовательности ДНК, нокауты гена, но не точные исправления. «Это был, мягко говоря, не тот дроид, которого мы искали», — говорит Урнов. Ситуацию вывел из тупика новый главный врач компании Дейл Андо.

— Я знаю, что нужно сделать, — заявил Андо, — и знаю, с каким геном и в какой болезни. Мы не будем заниматься синдромом мальчика в пузыре. Мы возьмемся за ВИЧ.

— Хм, окей, — сказал Урнов.

— Мы будем воздействовать на ген CCR5 T-клеток.

— Хорошо.

— И мы будем сотрудничать с Карлом Джуном.

— Это кто?

Андо засмеялся. Неплохой способ произвести впечатление в первый рабочий день.

Не многие области медицинских исследований в 1990-е годы были такими же актуальными и конкурентными, как изучение ВИЧ, описанного впервые как синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД) у нескольких пациентов в 1981 году. По мере распространения эпидемии учёные из Калифорнии обнаружили, что некоторые люди обладают врожденным иммунитетом к этому вирусу. Между тем несколько групп исследователей определили пути проникновения ВИЧ в лейкоциты — рецептор CD4 и корецептор CXCR4.

В июне 1996 года пять независимых статей, описывающих другой мембранный белок, CCR5 (C–C-рецептор хемокина 5), в качестве второго корецептора, были приняты в печать тремя ведущими научными журналами, причём все в пределах одной недели. Если ВИЧ был дирижаблем, который зацепился за Эмпайр-стейт-билдинг (CD4), то CCR5 был фуникулером, доставляющим пассажиров — генетический материал ВИЧ, на землю, в лимфоцит. Как и бульварная пресса, ведущие научные журналы конкурируют между собой, чтобы быть первыми в публикации прорывных научных исследований. Увы, одна из статей по CCR5 в журнале Cell была напечатана в такой спешке, что несколько страниц оказались перевернутыми.

Одним из главных авторов этой статьи был Марк Парментье, бельгийский врач-учёный, который предположил, что из-за различных вариантов в рецепторе CCR5 прогрессирование болезни у некоторых людей, инфицированных ВИЧ, может происходить медленнее. Команда Парментье взяла образцы трёх таких людей и обнаружила нехватку 32 оснований ДНК (Δ32, или «дельта 32») в середине гена CCR5. 

Размер этой делеции не оставлял сомнений в нарушении работы укороченного белка. После тестирования сотен образцов и добровольцев он, к удивлению, обнаружил, что вариант Δ32 был распространен среди европейцев — частота носителей (имеется в виду одна копия) около 10%, но ни у одного пациента с ВИЧ не было двух копий варианта Δ32. Один из коллег показал, что лейкоциты с геном Δ32 были устойчивы к ВИЧ-инфекции. К тому времени, когда Парментье представил статью в Nature в июле, другая группа получила те же результаты на большей выборке пациентов.

В 1980-х годах Стивен О’Брайен, руководитель лаборатории Национального института здравоохранения, начал поиск генетических факторов, влияющих на восприимчивость к ВИЧ и прогрессирование болезни. О’Брайен и генетик Майкл Дин начали систематический скрининг генов-кандидатов среди ВИЧ-инфицированных. Спустя двенадцать лет команда Национального института здравоохранения безуспешно проверила более сотни мутаций-кандидатов у тысяч пациентов, инфицированных ВИЧ. Однако изобилие статей о CCR5 показало, что этот ген — лучший кандидат. 

4 июля, пока О’Брайен смотрел премьеру фильма «День независимости», его команда неистово занималась секвенированием образцов. Они тоже обнаружили вариант Δ32, но не заметили ни одной гомозиготы по этому признаку у более чем 1300 пациентов с ВИЧ. Около 1–2% населения США — гомозиготы по Δ32, но ими почти никогда не бывают больные с ВИЧ. Без проникновения в лейкоциты ВИЧ может находиться в организме, но не инфицировать его.

Интерес представляет географическое распределение CCR5 Δ32: он наиболее распространен среди северных европейцев (частота 5–15%). Однако по мере перемещения дальше на юг или восток частота падает — Δ32 почти не встречается у жителей Африки и Азии. Подобная закономерность позволяет предположить, что этот признак прошёл положительный отбор по причине, не связанной с ВИЧ, который впервые инфицировал человека только в начале XX века. 

О’Брайен предположил, что единственное разумное объяснение — это «загадочная, захватывающая дух вспышка смертельного инфекционного заболевания, которое, подобно СПИДу, привело к огромной смертности и к которому были невосприимчивы носители CCR5 Δ32». Главный кандидат — чума, опустошившая Европу в Средние века. Возможно, вариант Δ32 возник в Скандинавии в ответ на более раннюю вспышку Чёрной смерти.

За год до волны открытий, связанных с рецептором CCR5, жителю Сиэтла по имени Тимоти Рэй Браун, пока он учился в Берлине, был поставлен диагноз ВИЧ. Он сдерживал развитие болезни, принимая смесь антиретровирусных препаратов, но в 2006 году, после участия в свадьбе в Нью-Йорке, по возвращении домой заболел. Его врач диагностировал анемию, но биопсия показала, что у Брауна острый миелолейкоз. Единственным лечением была пересадка костного мозга: к счастью, поиск потенциальных доноров выявил более 250 совпадений. Гематологу Брауна пришла в голову идея выбрать донора с дефектным геном CCR5. Из списка возможных кандидатов донор под номером 61 обладал вариантом Δ32.

Браун не хотел быть подопытным кроликом, но подписал соглашение на пересадку. Через три месяца после операции, в феврале 2007 года, вирус уже не обнаруживался в крови Брауна, и тот перестал принимать лекарства от ВИЧ. После того как лейкоз вернулся, Брауну провели вторую операцию в феврале 2008 года. Врачи наконец объявили, что он здоров и обладает нормальным количеством T-лимфоцитов.

Опыт Брауна дал представителям Sangamo много пищи для размышлений. Восстановление мутаций всё ещё было святым Граалем для многих болезней, но деактивация ключевых генов могла иметь важные медицинские преимущества в определенных ситуациях, включая ту, за которую выступал Андо. Цель состояла в том, чтобы попытаться «сконструировать ВИЧ-защитный генотип в клетках людей с ВИЧ-положительным статусом в надежде создать некую часть иммунной системы, которая будет защищена от инфицирования ВИЧ», вспоминает Урнов.

Когда Холмс возглавил программу по борьбе с ВИЧ, Sangamo наконец в 2009 году перешла к клиническим исследованиям в сотрудничестве (за что и выступал Андо) с Карлом Джуном, ведущим специалистом по генной терапии в Университете Пенсильвании. Спустя пять лет представители Sangamo сообщили о результатах, полученных у первой дюжины пациентов с ВИЧ, которые излечились благодаря своим же T-клеткам с отредактированным геном CCR5. 

Результаты были неоднозначными: терапия казалась безопасной и наблюдался некоторый противовирусный эффект, что позволило пациентам не прибегать к стандартной антиретровирусной терапии. В 2015 году Sangamo получила одобрение Управления США по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств (The United States Food and Drug Administration, FDA) на перенос концепции T-клеток на стволовые клетки с целью защитить часть клеток иммунной системы от заражения ВИЧ. 

IQ